4.4.2. Експерименти на щурах

Неоднозначність результатів клініко-фізіологічних спостережень спонукала нас до експериментальних досліджень. Метою експериментів було з'ясування впливу Нафтусі на ендотелійзалежні судинні реакції аорти щура при безпосередній дії води на судину, а також при тривалому поїнні щурів цією водою.

Досліди виконані на ізольованих препаратах грудного відділу аорти щурів-самців лінії Вістар масою тіла (м.т.) 200-250 г. Маса тимусу складала 0,55-0,1% м.т., що засвідчує репродуктивний вік тварин.

Судинні смужки завширшки 2-2,5 мм вміщували у термостатовану перфузійну камеру об'ємом 0,8 мл, де їх піддавали пасивному розтягуванню 13-15 мН і попередньо витримували 2530 хв. Судинні смужки перфузували стандартним розчином Кребса наступного сольового складу (мШл): NaCl - 133; KCl - 4,7; NaHCO3 - 16,3; NaH₂PO4 - 1,38; CaCl₂ - 2,5; MgCl₂ - 1,05; глюкоза - 7,8; pH - 7,4 (Базилюк О.В., 1988; Базилюк О.В., Бернштейн С.А., 1989) і тестуючим розчином, приготованим на воді Нафтуся (тест-РПНф), із швидкістю 7,2 мл/хв, при 36,6-37⁰С. Дев'ятикратний обмін розчинів у камері, впродовж однієї хвилини, запобігав накопиченню метаболітів. Попередній підігрів тест-розчинів здійснювали під час протоку по теплообмінниках, безпосередньо з'єднаних з камерою, для збереження біологічно активних мікробних метаболітів Нафтусі (Івасівка С.В., 1997).

Гладеньком'язеві клітини активували адреналіном (АД, 10^-5 М/л), а розслаблення спричинювали додаванням ацетилхоліна (АХ, 10^-5 М/л) вітчизняного виробництва.

Скорочувальну активність судинних гладеньких м'язів реєстрували при допомозі механо- електричного перетворювача типу 6МХ1С у режимі, близькому до ізометричного (Ткаченко М.М., 1997). Графічну реєстрацію зміни тонічного напруження гладеньких м'язів здійснювали при допомозі самописця КСП-4. Скорочувальну активність судинних гладеньких м'язів оцінювали згідно зумовленої АД максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження (мН) і зміни під впливом АХ.

Проведено 4 серії досліджень.

В 1-ій серії (n=5) дослідження проведені по схемі: 1-а реакція (контроль) - 5-хвилинна дія АД для визначення вихідного тонічного транзиторного напруження гладеньких м'язів, 5-хвилинна дія АХ для визначення величини їх ендотелійзалежного розслаблення з подальшим відновленням базального судинного тонусу; 2-а реакція - попередня 10-хвилинна перфузія судинної смужки інгібітором NO-синтази L-NAME (10^-5 М/л, Sigma, США) (Ткаченко М.М., 1998), з подальшою дією АД і АХ і відновленням базального судинного тонусу; 3-я реакція - попередня 10-хвилинна перфузія судинної смужки тест-РПНф з подальшою дією АД і АХ, розчинених у тест-РПНФ. Після завершення дії подразника препарат перфузували стандартним розчином Кребса для відновлення базального судинного тонусу.

В 2-ій серії (n=5) дослідження проведені по схемі: 1-а реакція (контроль) - така ж, як і 1-ій серії; 2-а реакція - хімічна деендотелізація перфузією розчином Кребса, що містив 0,3 мг/мл сапоніну (Merck, ФРН) (Базилюк О.В., Бернштейн С.А., 1989), відмивання розчином Кребса впродовж 30 хв з подальшою дією АД і АХ і відновленням базального судинного тонуса. Відсутність розслаблення попередньо активованих гладеньком'язевих клітин на АХ засвідчувала повноту усунення ендотеліального шару. 3-я реакція - 10-хвилинна перфузія деендотелізованої судинної смужки тест-РПНф з подальшою дією АД і АХ, розчинених у тест-РПНф. Після завершення дії подразника препарат перфузували стандартним розчином Кребса для відновлення базального судинного тонусу.

В 3-ій серії (n=5) дослідження проведені по схемі: 1-а реакція (контроль) - 5-хвилинна дія АД для визначення вихідного тонічного транзиторного напруження гладеньких м'язів, з подальшим відновленням базального судинного тонусу; 2-а реакція - 10-хвилинна перфузія судинної смужки тест-РПНф з подальшою дією АД, розчиненого у тест-РПНФ. Після завершення дії подразника препарат перфузували стандартним розчином Кребса для відновлення базального

судинного тонусу; 3-я реакція аналогічна 1-ій, для визначення залишкової реактивності судинних гладеньких м'язів.

В 4-ій серії (n=5) досліджень тварин дослідної групи попередньо поїли водою Нафтуся при допомозі зонду в дозі 1,5 % м.т. щоденно, впродовж 21-го дня. АД та АХ-індуковані реакції гладеньких м'язів цих щурів порівнювали з такими у інтактних тварин (контроль).

Приготування тестуючого розчину на воді Нафтуся

Згідно моніторингу макроіонного складу, осмолярність води Нафтуся в 21,8 рази нижча, ніж осмолярність розчину Кребса, через мізерний вміст іонів натрію, калію і хлору (табл.4.26).

Таблиця 4.26

Макроіонний склад розчину Кребса, води Нафтуся і тесстуючого розчину,

 

Водночас, вміст кальцію в 1,4 рази вищий у воді Нафтуся, ніж в розчині Кребса, а вміст магнію - вдвічі.

Таким чином, для приготування тестуючого розчину на воді Нафтуся (тест-РПНф) до 1 л мінеральної води слід додати в сухому вигляді (мМоль/л): NaCl - 140; NaHCO₃ - 8,1; NaH₂PO₄ - 1,38; KCl - 4,4; глюкози - 7,8.

Однак, збалансування макроіонного складу супроводжується порушеннями кислото-лужного балансу, оскільки рН тест-РПНф залишається в межах 7,07 - 7,10. Додаткове внесення 8,1 мМоль/л бікарбонат-іону підвищує рН тест-РПНф лише до 7,28-7,32. Через те, кінцеву корекцію рН до 7,387,42 здійснювали розчином NaHCO₃ (1 Моль/л) при безпосередньому моніторингу рН.

Нафтуся є вуглекислою мінеральною водою (конц. С0₂ - 50-60 мл/л), що формується на глибині до 60 м при температурі +6⁰С - +10⁰С. Її рН при температурі пласта є нейтральним: 6,937,08. Підігрів до кімнатної температури і часткова дегазація не змінюють кислото-лужного балансу мінеральної води (рН 6,98-7,10). Враховуючи, що бікарбонат-іон домінує серед аніонів мінеральної води, правомірно передбачити, що Нафтуся є природним бікарбонатним буфером, в котрому донором протону є, мабуть, четвертинний атом азоту органічних сполук.

З літератури відомо, що четвертинний атом азоту хінолізинового кільця забезпечує нейтральне рН водних розчинів берберину (Потопальсский А.И. и др., 1989). Водний розчин бікарбонату амонію (0,10 - 0,01 Моль/л) також є нейтральним буфером і успішно застосований нами для гель-фільтрації ліофілізатів води Нафтуся з метою ідентифікації її індивідуальних гідрофільних сполук (Івасівка С.В., 1997).

Таким чином, приготування тестуючого розчину на воді Нафтуся вимагає збалансувати воду по макроіонному складу і змінити її природні буферні властивості. Тест-РПНф є прозорим розчином, з легкою опалесценсією, відсутньою у нативній воді Нафтуся.

Фізіологічні дослідження

Підставою для дослідження впливу води Нафтуся на функціональну активність гладеньких м'язів аорти щура in vitro є три ідентичні послідовні реакції, зареєстровані на одній судинній смужці (рис. 4.13). Максимальна амплітуда тонічного транзиторного напруження, зумовленого АД, складає 4,5±0,8 мН, 4,2±0,6 мН і 4,6±0,7 мН для 1-ої (І), 2-ої (ІІ) і 3-ої (ІІІ) реакцій, відповідно, і зменшується під дією АХ на 66,7±3,1% у 1-ій (І), 67,2±3,5% у 2-ій (ІІ) і 66,8±3,6% у 3-ій (ІІІ) реакціях для 5-ти судинних смужок (n=5).

 

 

10-хвилинна перфузія судинної смужки аорти тест-РПНф не впливає на базальний рівень судинного тонусу, однак забезпечує приріст максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів, зумовленої АД, на 23,0±4,0 % (рис. 4.14,3) від вихідної величини (рис. 4.14,1). Тобто, максимальна амплітуда тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів, зумовлена АД, розчиненим у тест-РПНф, складає 5,5±0,2 мН і зменшується під дією АХ, розчиненого у тест-РПНф, на 25,0±3,0 % (рис. 4.14,3), n=5.

В 2-ій серії досліджень встановлено, що деендотелізація смужки аорти сапоніном супроводжується збільшенням максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів на 28,0±4,5 % і повною відсутністю розслаблення на АХ (рис. 4.15,2), n=5. 10-хвилинна перфузія деендотелізованої судинної смужки аорти щура тест-РПНф також не впливає на базальний рівень судинного тонусу, однак забезпечує приріст максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження, зумовленої АД, на 56,0±6,4 % (рис. 4.15,3) від вихідної величини (рис. 4.15,1), n=5. Розслаблення на АХ також відсутнє.

Виявлено (рис. 4.11), що БАВН per se впродовж 20 хв після вживання спричиняє закономірне поступальне збільшення кровоплину через просвіт a. cubitalis, від 73 мл/хв до 109 мл/хв. Наступна компресія передпліччя на цьому фоні спричиняє таку ж, як і в базальному періоді, пікову гіперемічну реакцію, проте її виразність, якщо судити за відношенням Vr/Vb, зменшується від 38% до 16%.

 

При перфузії тест-РПНф деендотелізованої смужки аорти щура біологічно активний кальцій Нафтусі здатний, мабуть, накопичуватися безпосередньо в гладеньком'язових клітинах. Загальновизнано (Чекман И.С., 1991), що надходження позаклітинного кальцію (в наших дослідження - кальцію води Нафтуся) забезпечується стимуляцією його транспорту по повільним кальцієвим каналам. Водночас, надходження позаклітинного кальцію сприяє його вивільненню із саркоплазматичного ретикулюму, що контролюється інозитол-1,4,5-трифосфатом. Останній, в свою чергу, підсилює трансмембранний кальцієвий струм, підвищує чутливість скоротливих білків до кальцію, завдяки стимуляції фосфоліпази С (Мойбенко О.О. та ін., 1997), а отже, підвищує скорочувальну активність гладеньких м'язів.

В 3-ій серії дослідження виконані на щурах репродуктивного віку (маса тимусу - 0,05-0,1 % м.т.) і старечого віку (маса тимусу - 0,02-0,04 % м.т.). Підставою для проведення досліджень, як і в двох перших серіх, є три ідентичні послідовні реакції, зареєстровані на одній судинній смужці. Максимальна амплітуда тонічного транзиторного напруження, зумовленого АД, складає 1,8±0,1 мН, 1,9±0,1 мН і 1,9±0,1 мН для 1-ої, 2-ої і 3-ої реакцій, відповідно.

Встановлено, що у щурів репродуктивного віку (n=16) 10-хвилинна перфузія судинної смужки аорти тест-РПНф не впливає на базальний рівень судинного тонусу, однак забезпечує приріст максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів, зумовленої АД, на 37,8±8,0 % (рис. 4.16,2) від вихідної величини (рис. 4.16,1). При цьому, кінцева активація судинних гладеньких м'язів АД також забезпечує приріст максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження на 36,7+11,0 % (рис. 4.16,3).

 

⁶ ХВ

Рис. 4.16. Вихідна максимальна амплітуда тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів, зумовлена АД (1), дія тест-РПНф (2) і завершальна дія АД (3) у щурів репродуктивного віку

Правомірно дійти висновку, що Нафтуся суттєво змінює метаболізм в ендотеліїї щурів репродуктивного віку.

У І підгрупі щурів старечого віку (n=6) 10-хвилинна перфузія судинної смужки аорти тест- РПНф зумовлює такі ж зміни, як і в щурів репродуктивного віку, тобто не впливає на базальний рівень судинного тонусу, однак забезпечує приріст максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів, зумовленої АД, на 43,8±9,3% (рис. 4.17,2) від вихідної величини (рис. 4.17,1). При цьому, кінцева активація судинних гладеньких м'язів АД забезпечує приріст максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження на 25,0±9,5 % (рис. 4.17,3).

У II підгрупі щурів старечого віку (n=4) 10-хвилинна перфузія судинної смужки аорти тест- РПНф також не впливає на базальний рівень судинного тонусу, забезпечує приріст максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів, зумовленої АД, на 36,3±16,2%. Однак, кінцева активація судинних гладеньких м'язів АД супроводжується зменшенням максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження на 16,3±3,6% (рис. 4.17,4) від вихідної величини (рис. 4.17,1).

 

Правомірно дійти висновку, що Нафтуся здатна порушувати ендотелійзалежні компенсаторні механізми регуляції судинного тонусу у щурів старечого віку.

В 4-ій серії досліджень встановлено, що 21-денне поїння щурів водою Нафтуся в дозі 1,5% м.т. щоденно супроводжується зменшенням максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів на 66,7±7,4% (n=5) в порівнянні з інтактними тваринами (рис. 4.18). При цьому ендотелійзалежне розслаблення судинних гладеньких м'язів, спричинене АХ, повністю відсутнє у дослідних тварин. Отримані дані правомірно розцінювати як суттєве порушення функціональної активності ендотелію за умов тривалого надходження води Нафтуся в організм.

Відомо, що ендотелій збагачений мікросомальними монооксигеназами (Mc Donald B.J., Bennef B.M., 1993), потенційно здатними окислювати гідрофобну органіку води Нафтуся. !ндукований гідрофобними органічними речовинами води Нафтуся синтез цитохрому Р₄₅₀ і подальше мікросомальне окислення цих речовин супроводжується утворенням і накопиченням супероксид-аніону (0₂^-) (Зайцев В.В., 1985), котрий окислює NO до пероксинітриту (ONOO^-) (Покровский В.И., Виноградов Н.А., 2005), токсична дія котрого полягає в інтенсифікації окислення білків цитомембран, протеїноліпідних комплексів рецепторів та ДНК (Ванин А.Ф., 2000). Ці процеси здатні ініціювати зміни функціонального стану ендотелію, підвищення проникності судинної стінки, а, отже, і запальний процес, що може привести до виникнення судинної патології.

 

На нашу думку, уникнути негативного впливу води Нафтуся на судинні реакції при її тривалому надходженні в організм можна шляхом приготування преформованих лікарських чинників на основі води Нафтуся. А саме, воду Нафтуся необхідно піддати ліофілізації, ліофілізат повторно розчинити у бідистильованій воді, від центрифугувати, внаслідок чого отримують супертанант з виключно гідрофільними органічними речовинами води Нафтуся, інертними щодо цитохрому Р₄₅₀ (Івасівка С.В., 1994; 1997).

Таким чином, тестуючий розчин Нафтусі не впливає на базальний рівень судинного тонусу цілісної і деендотелізованої смужки аорти щура, однак потенціює констрикторну дію адреналіну на гладенькі м'язи і зменшує ендотелійзалежне їх розслаблення, спричинене ацетилхоліном, тобто проявляє деендотелізуючий ефект. Тривале надходження води Нафтуся в організм супроводжується зменшенням максимальної амплітуди тонічного транзиторного напруження судинних гладеньких м'язів при дії адреналіну і відсутністю їх розслаблення при дії ацетилхоліну. Ці зміни, певно, зумовлені ксенобіотичними властивостями води Нафтуся.

Отримані результати передбачають потенційну можливість отримання преформованих лікарських чинників з води Нафтуся (виключно її гідрофільних органічних речовин), показаних для профільних хворих курорту Трускавець з супутньою серцево-судинною патологією.